UDK: 61+061.231=862=20
Maked med pregled 2001; 55(Suplement 47):59-67

CODEN: MKMPA3

ISSN 0025-1097
Maked med pregled 2001; 55(Supplement 47):59-67

 

STANDARDIZACIJA NA TIROZIN- ADSORBIRANITE SO GLUTARALDEHID MODIFICIRANI DRVNI POLENOVI EKTRAKTI (Polinex® Trees)

 

Alan Viler, Beverli Liz, Allergy Therapeutics Ltd, Velika Britanija

 

STANDARDISATION OF TYROSINE-ADSORBED GLUTARALDEHYDE- MODIFIED TREE POLLEN EXTRACT (POLLINEX® Trees)

 

Alan W. Wheeler, B Lees, Allergy Therapeutics Ltd, United Kingdom

 

 

D-r Wheeler imal preku 30 godini iskustvo vo istra`uvawe i razvoj vo farmacevtskata industrija, najprvo so Beecham, a potoa so SmithKline Beecham Pharmaceuticals. Od noemvri 1996 gosina toj edirektor na Allatract Ltd. (ATL), a raboti i kako konsultant vo poleto na alergii. Od skoro stanal direktor vo upravniot odbor na ATL i odgovoren za nauka i kontrola na kvalitetot. Negovata rabota na imunologijata na penicilinite e dobro poznata i ~esto citirana. Vo ponovo vreme toj e aktivno vklu~en vo razvojot na novi formi na modificirani alergeni za imunoterapija, a od 1984 godina vo razvojot na alergolo{kata dijagnostika i imunoterapija. D-r Wheeler e odgovoren za pretstavuvaweto na prviot Tpo1- inducira~ki adjuvans vo kombinacija so alergiski vakcini. ^len e na Britanskoto zdru`enie za imunologija (BSI), Kralskoto zdru`enie za medicina, Britanskata fondacija za aerobiologija (BAF), Britanskoto zdru`enie za alergologija i klini~ka imunologija (BSACI), Evropskata akademija za alergologija i klini~ka imunologija (EAACI) i drugi. D-r Wheeler e biolog so golemo iskustvo i detalni poznavawa na in vivo i in vitro imunologijata i objavil preku 150 trudovi. Doktor e na medicinski nauki, titula steknata kaj Prof. S. G. O. Johansson na Karolinska institutot vo Stokholm.

 

 

IZVADOK

Imunoterapijata, protiv-alergiskata vakcinacija se koristi ve}e mnogu godini so razli~en uspeh. Dolgo vreme bile koristeni vodeni alergenski ekstrakti, no od neodamna aluminium hidroksidot e pretstaven kako depo adjuvans koj ovozmo`uva vremeto na vnesuvawe da bide skrateno. Ovde e prika`an konceptot na upotreba na alergiski ekstrakti modificirani so glutaraldehid koi se mnogu pobezbedni za koristewe poradi nivnata namalena reaktivnost so IgE protivtelata. Dopolnitelno koristime nerastvorliva forma na tirozin kako depo tip na adjuvans. Produkti kako: Pollinexes i TA Mix Top Range mo`e da se koristat za tretirawe na zna~ajna osetlivost kon polen. Diskutirani se prednostite na ovie produkti.

Kvalitativnata kontrola i standardizacijata se va`ni delovi od proizvodstvoto i obezbeduvaweto na vakcinite protiv alergii. Opi{ana e na{ata strategija koja e vo soglasnost so Evropskiot sovet. Produktite se kontroliraat vo soglasnost so zabele{kite na ES za sovetuvawe za registracija na alergiskite produkti kako i so EP monografijata Producta allergica.

Klu~ni zborovi: specifi~na imunoterapiija; alergenski ekstrakti; modifikacija so glutar aldehid; depo tirozin.

 

SUMMARY

Immunotherapy, allergy vaccination, has been used for many years with variable success. For a large period of time longlasting courses of aqueous extracts have been used, although recently aluminium hydroxide has been introduced as a depot adjuvant allowing injection courses to be shortened. We have introduced the concept of using glutaraldehyde modified allergen extracts, which are much safer to be used as there is a reduction in their reactivity with IgE antibodies. In addition, we use the biologically acceptable insoluble form of tyrosine as a depot-type immunological adjuvnt. Such products as Pollinexes and TA Mix Top Range, can be used to treat a number of important pollen sensitivities. The advantages of such products are discussed. Quality control and standardisation are essential parts of manufacturing and supply of allergy vaccines. Our strategy which is in, agreement with the European Council, is described. The products are controlled according to the EC notes for Guidelines for registration of allergy products as well as the EP monograph, Producta Allergenica.

Key words: specific immunotherapy; allergen extracts; modification with gltaraldechide; depo tyrosine.

 

Tirozin-adsorbiranite so glutaraldehid modificiran ekstrakt za vakcina od drvni poleni (POLLINEX® Trees, Baumpolen, Polvak Baume) se upotrebuva vo tekot na mnogu godini za uspe{en tretman na I tip alergiska vkrstena reakcija na poleni od breza, evla i leska. Se pretpostavuva deka, imunoterapijata ja poka`uva svojata efikasnost preku promena na Tpo- kleto~niot profil od Tpo2 kon dominantno Tpo1 citokinski tip. Taka, modificiranite alergeni kade IgE reaktivnosta e reducirana od bezbednosni pri~ini se pogodni, bidej}i T-kleto~nata reaktivnost ne e reducirana preku modifikacijata. Ova se slu~uva bidej}i T-kleto~nite epitopi se vo vid na IgE epitopi, obi~no se prilagodlivi i zatoa se i uni{teni so modifikacijata. Produktot sodr`i inicijalna terapija od tri subkutani injekcii so ja~ina {to se zgolemuva, koja e pratena od prodol`itelna terapija od tri injekcii so najgolema ja~ina. Terapevtskite vakcini za alergija, kako {to se POLLINEX® Trees se farmacevtski produkti i zatoa se predmet na registracija, so cel da se obezbedat licencite za produktot. Ovoj produkt e napraven so inspekcija od MCA i GMP.

 

Evropska legislativa

Barawata za registracija na Terapevtski alergiski vakcini (kako {to se POLLINEX® Trees) se vklu~eni vo Bele{ki na EU za preporaki (1) i vo EP monografijata na evropskata farmakopeja “Producta Allergernica”(2). Ovie barawa gi obvrzuvaat proizvoditelite deka podatoci mora da bidat obezbedeni, za da se dobie licenca za produktot i toa za sekoj posebno. Testovi za validnost se baraat za kontrola na kvalitetot na produktite. Ova se primenuva na razli~ni stadiumi na procesot na proizvodstvo, za da se potvrdi reproduktibilnosta na seriite kako i za ~istotata i proizvodstvoto na finalniot produkt. Specifikacii i podatoci za stabilnosta se podnesuvaat kako del od procesot na registracija.

Proceduralno site sostojki na alergiskite vakcini se sekoga{ predmet na analizi i pokraj toa {to aktivnite sostojki go privlekuvaat najgolemoto vnimanie vo tekot na poslednata dekada. Za da se obezbedi konzistencija od edna do druga serija, me|u najva`nite barawa e potrebata od standardizacija na potentnosta na produktite ili me|uproduktite.

Vo slu~aj na modificirani aklergenski ekstrakti i onie adsorbirani na slabo rastvorlivi nosa~i koi se koristat kako depo adjuvansi, razli~nite preporaki im nalagaat na proizvoditelite da gi primenat glavnite ispituvawa za Kontrola na kvalitetot na me|uproduktnite ekstrakti pred da se izvr{i modifikacija i/ili adsorbcija. Pri~inata za ova e faktot {to testovite koi ~esto se koristat naj~esto se temelat na IgE reaktivnosta na alergenite. Ovaa reaktivnost na modificirani alergeni e namerno zna~ajno reducirana, za da gi namali nesakanite efekti koi mo`e da se predizvikaat so injektirawe na produktot. I pokraj toa {to e va`no da postoi kontrola vrz me|ufazite na proizvodniot proces i da se osigura postoewe na relevantni alergeni, standardizacijata na finalnata forma na produktot vo realnosta e od najgolemo zna~ewe. Ovie standardizaciski strategii se opi{ani na kratko vo trudot.

 

Sirov materjal

Polenite od breza (Betula), evla (Alnus) i leska (Corylus) se nabavuvaat od izbrani nabavuva~i. Tuka se vklu~eni specifikaciite, koi me|u drugoto ja deklariraat sodr`ina na vodata, identitetot i dolnite grani~ni vrednosti na drugite poleni, drugi delovi od rastenieto i gabi~nite spori. Merewata i nivnata identifikacijata se izveduva preku izoelektri~no fokusirawe, prosledeno so boewe na proteinskite lenti so Komasi sino. Rezultatite od ovie testirawa na seriite od brezov polen, kako primer e pretstaveno na Sl. 1, za da se ilustrira dobra reproduktibilnost na seriite.

 

Sl. 1. IEF proteinski lenti na podatocite od serija 4 so po~eten voden ekstrakt.

 

Proces na proizvodstvo

Nakratko, vodenite ekstrakti prigotveni od polen se modificirani so glutaraldehid, a potoa adsorbirani na slabo rastvorliva aminokiselina L-tirozin.

 

Voden rastvor

Vodeniot rastvor, podednakva me{avina po te`inski koli~estva od trite vida poleni so vkrstena reaktivnost e napraven vo puferiran solen rastvor. Za potvrduvawe na reproduktibilnosta na seriite se koristat razli~ni testovi. Na primer, vkrstenata imunoelektroforeza (CIE) se upotrebuva so koristewe na poliklonalen zaja~ki antiserum kon najva`nite alergeni od brezov polen (Bet V 1) za da se zadovolat barawata za merewe na glavniot alergen. Rezultatite od ovaa analiza se pretstaveni na Sl. 2. Isu{en so mrznewe polenski ekstrakt od breza, od samata institucija kako referenten standard se upotrebuva za komparacija i e nazna~en kako 1000 edinici za potvrda na kvalitetot (QAU/ml). Taka, ja~inata na po~etniot ekstrakt mo`e da se izrazi vo QAU/ml. Ja~inata na vodeniot rastvor mo`e da se pretvori od QAU vo mikrogrami na glavniot alergen, ako toa e potrebno. Vaka obi~no ne se izrazuvaat vrednostite, bidej}i se dobiva vpe~atok na apsolutno merewe, koe zavisi od prirodata na reagensite kako {to se monoklonalnite antitela i rekombinantnite alergeni koi se upotrebeni vo inicijalnata determinacija.

Sl.2. Merewe na glavniot brezov alergen (BetV1), vo voden rastvor preku CIE

 

SDS PAGE se izveduva za da se potvrdi reproducibilnosta na proteinskiot profil. Ova se pretvora vo imunoblot i se razviva so pove}e serumi od pacienti alergi~ni na drvni poleni i enzimski

 

Alergenski profili so SDS imunobloting kon ~ove~ki IgE

 

ELISA inhibicijata se izveduva za da se potvrdi deka alergenskata aktivnost (reaktivnost so IgE) e reproducibilna od serija do serija. Ova e novo barawe koe se nalaga od regulatornite vlasti i taka samo limitirana koli~estva na podatoci od serijata e na raspolagawe za prezentacija. Komparacijata se pravi so referenten preparat od institucijata i se izrazuva vo QAU/ml. Paralelni linearni statisti~ki biotestovi se koristat za kompjuterska obrabotka na podatocite. Rezulatite za odreden broj na serii se prezentirani vo Tab. 1.

Sl 3. Proteinski i alergenski profili na ~etiri sukcesivni serii.

 

 

 

Proteinski profili so upotreba na SDS PAGE preku zlatno boewe

 

Tab. 1: IgE reaktivnosta kon sukcesivni serii na vodeni ekstrakti so ELISA inhibicija

broj na serija

IgE reaktivnost vo QAU/ml

J7040

98

J7237

80

J7293

115

K7063

80

M7111

129

 

Modificiran ekstrakt

Vodeniot ekstrakt se modificira so pro~isten glutaraldehid. Ovoj reagens reagira glavno so primarnite aminogrupi na proteinite vnatre vo ekstraktot. Taka, stepenot na modifikacijata mo`e da se kontrolira preku merewe na zagubata na ovie grupi. Za ovie celi se upotrebuva fluramskiot test (fluorometriski metod). Rezultatite koi se naveduvaat za sukcesivni serii na modificiranite ekstrakti se dadeni vo Tab.2.

 

Tab. 2: Gubitok na primarnite amino grupi koi rezultiraat od glutardehid modifikacijata na vodenite ekstrakti: reproducibilnost od serija na serija.

 

Broj na serija

% na modifikacija

J 7295

69

J 7318

69

J 7326

66

P7336

72

P7337

70

 

Tirozin adsorbcija

 

Modificiraniot alergenski ekstrakt se rastvora vo puferiran solen rastvor, koga nastanuva koprecipitacija so tirozin preku dodavawe na poedine~ni aplikacii na acidofilen rastvor na L-tirozin i natrium hidroksid. Preku ciklusi na centrifugirawe i miewe, tirozin adsorbiraniot i modificiran ekstrakt se podgotvuva vo vid na inekciski preparat, so razli~ni ja~ini preku razreduvawe vo ~ist L-tirozin.

Glavniot test za ja~inata se primenuva na finalniot produkt. Principot na testot se bazira na faktot deka i pokraj toa {to modificiraniot ekstrakt ima vo golema merka reducirana reaktivnost so IgE antiteloto, sposobnosta za reakcija so IgE antiteloto vo osnova e zadr`ana. U{te edna{ e napravena komparacija so referentniot ekstrakt so cel da se dobijat vrednosti za ja~inata vo Standardizirani edinici (SU). Za da se postigne ova, razvien e metod za solubilizacija na produktot so {to ne se degradira aktivnata komponenta. Podatocite od seriite se prezentirani vo Tab. 3.

 

Tab.3: Reproducibilnosta na serijata od finalniot produkt

 

Broj na serijata

Ja~ina na serijata vo SU/ml

P7193

4713

P7190

4162

P7242

5202

M7425V

4078

P7322L

4853

M7286

4542

 

Vlastite odgovorni za registracija i pu{tawe vo promet na lekovi insistiraat da bide doka`ana postojana adsorbcija vo slu~aj da se raboti za alergiska vakcina za koja se upotrebuva depo adjuvans, kako {to e tirozinot. Ova se postignuva so testirawe i kontrolirawe na proporcijata na modificiraniot ekstrakt, koj e prisuten vo supernatantnata komponenta na produktot.

Zaklu~oci

· Vo ALT razviena e strategija za standardizacija na glutaraldehid modificiranite so tirozin adsorbiranite alergenski ekstrakti.

· Ovaa strategija e vo soglasnost so barawata na regulatornite vlasti, preporakite i EP.

· Site fazi na proizvodstvo se izveduvaat pod kontrola na GMP.

· Procedurite za kontrola na kvalitetot ovozmo`uvaat reproducibilnost na seriite vo soglasnost so baranite specifikacii.

· Edinicata SU se aplicira na finalniot proizvod koe se bazira na procenka na reaktivnosta na modificiraniot ekstrakt so alergen specifi~no IgE antitelo.

· Najgolemata doza na produktot koja pacientot ja prima sodr`i 6 mgr od glavniot brezov alergen (Bet v 1).

 

Literatura

1. Notes for Guidance on Allergen Products. CPMP/BWP/243/96.

2. Allergen Products (Producta allergenica) European Pharmacopoeia 1997, 1063-8.

 


Copyright (c) 2001 by Macedonian Society of Basic, Clinical Immunology and Allergology.
All rights reserved.
WEB design: Mirko Spiroski, MD, PhD
Optimally viewed with Internet Explorer
Revised: March 5, 2001